新基因信息速递NCDN双等位基因变异导致

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神经软骨蛋白（Neurochondrin，NCDN）是一种胞质神经蛋白，对神经生长、谷氨酸受体（glutamatereceptor，mGluR）信号传导和突触可塑性具有重要作用。小鼠神经组织中Ncdn的条件性缺失可导致抑郁样行为、空间学习障碍和癫痫发作。该研究报告了6例患有不同程度发育迟缓、智力残疾（ID）和癫痫发作的患者NCDN基因错义变异。三个兄弟姐妹被发现是NCDN基因错义变异的纯合子，而另外三个无关个体在NCDN基因中携带不同的新发错义变体。研究分析了NCDN基因错义变异人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞中保护受损神经突起形成的能力，野生型NCDN的过度表达保护了神经轴突表型，这与包含受累个体变体的NCDN的表达相反。与严重的神经发育特征和癫痫相关的两种错义变异不能恢复mGluR5诱导的ERK磷酸化。对缺失变异的NCDN基因SH-SY5Y细胞的电生理分析显示，膜电位改变，复极时动作电位受损，提示NCDN是正常生物物理特性所必需的。利用人类胚胎皮质的转录组数据，我们发现NCDN在成熟的兴奋性神经元中高度表达。总之，我们的数据证明NCDN的双等位基因和新发变异可导致神经发育迟缓和癫痫的临床特征，突出了NCDN在人脑发育中的关键作用。

该研究初期确定一个巴基斯坦血统的近亲家庭，对三个表现出神经发育迟缓、轻度ID和癫痫症状的兄弟姐妹进行分析。父母为表亲关系，体健，没有NDD家族史。对两个患病兄弟进行全外显子组测序（WES）发现NCDN中具有未知意义的纯合错义变体（c.Gc[p.GluGln]）。父母为杂合子，而三个受累的兄弟姐妹都是纯合变异（图1A）。根据MutationTaster和CADD评分，c.Gc变体被预测为致病性，但Sift和PolyPhen-2评分为可耐受和良性。NCDN的表达模式和已知功能使得研究团队寻找具有NDD和NCDN变异的独立受累个体。通过网络平台，该团队确定了另外三个单纯受累个体，分别是法国人（F2:II.1）、中国人（F3:II.1）和日本人（F4:II.1）携带NCDN变体（图1A）。这三个独立的受累个体表现出不同程度的神经发育延迟，并在NCDN中分别携带不同的杂合新发变异（c.1Ga[p.ArgGlu]、c.Tc[p.TrpArg]和c.CT[p.ProLeu]）（图1A-1C）。发现这三种错义变体的phastCons得分为1，它们位于高度保守区域，并且根据MutationTaster、Sift和PolyPhen-2表明变异具有致病性。MetaDome进一步预测了NCDN（UniProt:Q9UBB6）中每个氨基酸（aa）位置的遗传耐受性。p.GluGln变异被认为是“轻度耐受”（耐受分数=1.01），而p.ArgGlu（耐受分数=0.32），p.TrpArg（耐受分数=0.29），p.ProLeu（耐受性得分=0.4）被认为是“不耐受的”（图1D）。NCDN的错义Z值为3.76（观察值/预期值=0.51[0.46–0.57]），而同义Z值为0.73（o/e=0.94[0.83–1.05]），表明该基因对错义变体高度不耐受。这一点得到了?1.77的残余变异不耐受评分（RVIS）的支持，表明NCDN是4.2%最不耐受人类基因变异的基因之一。

图1神经发育表型家系中罕见NCDN错义变异的分类

（A）四个无血缘关系家庭谱系，受累成员为实心圆圈（女性）和正方形（男性）。双横线表示血缘关系（表亲）；

（B）每个NCDN变异的sanger图用垂直红框和箭头表示；

（C）在本研究中，NCDN跨越7个外显子的示意图以及变异体的相对位置。方框区域表示编码序列，白色框区域表示未翻译区域。

（D）通过MetaDome和四个预测氨基酸（aa）替代物的相对位置观察NCDN错义变体的耐受性。该图表明，接近mGluR5相互作用域（灰框）或在其内的变体较难耐受。受隐性错义变异c.Gc影响的p.Glu位点“稍有耐受性”，而三个杂合的从头变异对aa替换“不耐受”。

NCDN新发变异的三个受累个体的临床特征与c.Gc纯合子的三个受累同胞的临床特征具有重叠。表1总结了六个受累个体的表型发现。所有1个月至4岁的患者均诊断为神经发育迟缓。后续调查显示从轻微到严重不等的智力残疾（ID）。所有6个受累个体都有语言延迟，其中5/6的个体在2-3岁时出现语言延迟，现在有一个个体在5岁时仍无语言功能。3/6的患者在3-5岁时可具有行走能力。一例在5岁时仍然不能走路。四名患儿已年满10岁，但读写能力相比延迟了2-4年。2/6患儿的头围减小（-2SD），4/6患儿的头围略有减小（-1SD）。此外，在家系1的三个兄弟姐妹（F1:II.1、F1:II.2和F1:II.3）和个体F4:II.1中发现普遍生长迟缓。个体F4:II.1表现为内斜视、高度近视和内眦赘皮，但面部畸形在其他患儿中不存在。癫痫在5/6患儿被诊断，表现为全身性癫痫（n=4）或局灶性癫痫（n=1）。家族1中的三个患病兄弟姐妹有散发性或高热惊厥，而两个患儿（F3:II.1和F4:II.1）有早发性肌阵挛性脑病病史。这两名患者在神经外科手术（F3:II.1）或用促肾上腺皮质激素（ACTH）和唑尼沙胺（F4:II.1）治疗后均无癫痫发作。脑电图（EEG）显示三个受累同胞有轻微的致病性，受累个体F3:II.1和F4:II.1有轻度心律失常。磁共振成像（MRI）在三个独立的受累个体中显示F3:II.1个体的髓鞘形成延迟，而在F1:II.1和F4:II.1个体中未检测到明显的结构异常。

表16例NCDN错义变异患者的临床表现

在该研究中，癫痫发作是5/6患者的共同特征。此外，中枢神经系统Ncdn纯合子条件性缺失的小鼠模型表现出癫痫症状。因此，我们利用全细胞膜片钳记录研究Ncdn缺陷的SH-SY5Y细胞的电生理特性。对KO#9和WT-SH-SY5Y系进行了7天的分化培养。当通过电容测量进行评估时，两种培养物的细胞大小相似。膜片钳分析显示，与WTSH-SY5Y（38.23mV±1.58mV；图S5B）相比，KO#2和KO#9线（?45.00±0.55mV）存在静息膜超极化。在ms矩形电流注射后，去NCDN的线显示出流产动作电位（APs），并且在APs的上升阶段没有差异。然而，AP复极动力学显著不同，并且NCDN缺陷细胞中的复极率（mV/ms）对不同的注射电流有反应。这些观察结果强烈提示NCDN缺陷和分化的SH-SY5Y细胞的电生理特性发生改变，与NCDN条件性缺失小鼠的癫痫发作相一致。

然后，研究者利用现有的和先前发表的数据，试图研究人类胎儿皮质中NCDN的表达模式。在这些数据中，研究者观察到NCDN表达在由NEUROD6（MIM:）表达定义的兴奋性神经细胞中富集（图3E）。具体来说，NCDN的表达主要见于成熟的兴奋性神经元（mENs），由谷氨酸离子受体基因GRIN2B的表达决定（MIM:）但在未发育成熟的兴奋性神经元（iENs）中没有，由NRP1（MIM:）表达定义（图3F）。类似地，GRM5表达分析显示，表达水平仅限于男性。这些数据表明，NCDN与GRM5一起在胎儿皮质的男性中高表达，与NCDN和mGluR5之间的相互作用一致。

该研究的六例患有NCDN变异的受累个体有几个共同的NDD核心特征，如学习障碍和ID、语言发育迟缓和不同程度的头围缩小。虽然所有四种NCDN变异都未能恢复NCDN缺失的SH-SY5Y细胞中受损的神经突起形成，但遗传、发病、严重程度和症状组合在不同的家族中有所不同，而在受累个体中没有共同的临床特征。具有双等位基因NCDN变异体c.GC的三个同胞（F1:II.1、F1:II.2和F1:II.3）表现为生长迟缓、轻度ID和散发性或发热性癫痫发作的统一表型。他们的杂合子父母既没有神经症状，也没有认知障碍。个体F2:II.1携带杂合从头变异c.1GA，表现出类似的轻度ID和语言延迟，但没有癫痫发作。另一方面，个体F3:II.1和F4:II.1分别具有从头变异c.TC和c.CT，在我们的系列患者中表现出更严重的发育迟缓，起病较早，中度至重度ID和癫痫痉挛。有趣的是，在该研究实验中，位于mGluR5相互作用域的c.TC和c.CT变体的体外表达干扰了mGluR5诱导的ERK磷酸化。根据我们的临床观察和实验数据，我们很容易推测c.GC和c.1GA变体，在该研究分析中没有促进轴突形成的能力，也没有检测到对ERK磷酸化的影响，改变NCDN功能的方式与c.TC和c.CT变体稍有不同，显示mGluR5介导的ERK磷酸化减少（图3A）。在先前的一份报告中，有三个个体被鉴定为新发杂合缺失，范围为1.1Mb到3.1Mb，涉及NCDN。这三个受累个体表现为轻度到中度ID和运动和语言延迟。然而，没有关于癫痫发作的报道，这表明NCDN单倍体不足并不一定会引起癫痫。因此，在该研究中与三种错义变体相关的癫痫发作定义了一种由显性负效应介导的亚表型。在这种情况下，家族1中的变异NCDN等位基因c.GC应该是亚型的，以解释杂合子父母的正常表型。与对应于c.1G、c.T和c.C三个位置的aa残基相比，核苷酸位置c.G的phastCons评分较低（0.），相应的aa残基的耐受性更高（MetaDome耐受评分），这与亚型现象作为合理解释是一致的。在编码鸟嘌呤核苷酸交换因子的三个（MIM:）中，错义变体介导单倍体不足或功能获得导致不同表型。与DEAF1和TRIO类似，NCDN与多种蛋白质相互作用并影响中枢神经系统的不同功能。因此，我们认为这四种不同的错义变体可能导致NCDN功能的不同和特定领域的变化，最终导致表型变异。关于已鉴定的NCDN变异体如何干扰与不同蛋白质伙伴结合的详细理解仍需要进一步的研究。

总之，该研究确定了四种不同的错义变异在NCDN中相关功能，这六种变异表现为不同程度的神经发育延迟、ID和癫痫。六个受累个体中有五个被诊断为不同类型的癫痫，这是NDD的一个核心表型特征，与普通人群相比，ID个体的患病率增加了10倍。三个NCDN变异是新发的，而一个变异在三个兄弟姐妹中以双等位基因状态分离，临床表现一致。四种NCDN变体的功能特性表明，与WT-NCDN相比，它们不能恢复NCDN缺失的SH-SY5Y细胞中受损的神经突起形成。此外，在两个具有严重NDD临床特征的个体中，通过ERK磷酸化水平测量的mGluR信号被位于蛋白mGluR5结合域的NCDN变体破坏。尽管在该研究分析中显示了四种NCDN变异的功能效应，但导致不同临床表现和不同遗传模式的确切机制仍然难以捉摸。中枢神经系统Ncdn条件性缺失的小鼠表现出学习障碍和癫痫。这些特征与我们的五个受累个体的表型一致，但是它们不是由功能完全丧失介导的。此外，NDD患者的大杂合子缺失提示NCDN单倍体不足与癫痫无关。鉴于NCDN在发育过程中与中枢神经系统中的多个伙伴相互作用，并且所鉴定的NCDN变体可能以不同的方式影响这些相互作用，因此我们假设这些变体以不同的方式干扰NCDN功能，最终导致不同的临床特征。然而，单等位基因和双等位基因NCDN变体的可变分子、细胞和临床效应的精确机制解释需要进一步研究，需要绘制NCDN的功能域及其三维结构。

以下是该研究的实验过程，斟酌阅读

为了阐明NCDN变异的病理学因素，研究者利用人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y建立了一个NCDN基因缺失变异的神经细胞模型。当用维甲酸（RA）刺激时，野生型（WT）SH-SY5Y细胞获得神经元样表型，如神经突起形成、电兴奋性、神经细胞凋亡、神经细胞凋亡和神经细胞凋亡，以及神经递质和神经递质受体的表达。我们使用CRISPR/Cas9靶向WTSH-SY5Y细胞中的NCDN，并扩增了两个具有不同NCDN纯合缺失的单独克隆，一个跨越16bp（c.del16；SH-SY5YNCDNΔ16/Δ16），分配KO#2，另一个跨越bp；（chr1:，–；SH-SY5YNCDNΔ/Δ），分配KO#9。16bp缺失（KO#2）位于NCDN的外显子5，bp缺失（KO#9）跨越内含子3到外显子5。据预测，这两种缺失变异分别会导致提前终止编码p.AlaAlafs*45和p.ValAlafs*24。研究者还通过转染含有CRISPR/Cas9但不含gRNA的WT-SH-SY5Y细胞生成了一个对照组，命名为“对照-Cas9”。通过Sanger测序分析预测的顶部脱靶位点，并揭示了KO#2和KO#9克隆中的WT序列。此外，通过免疫印迹分析证实两个克隆中的NCDN蛋白缺失（图2A）。考虑到NCDN对神经发生的影响，然后研究者用RA对“对照-Cas9、KO#2和KO#9细胞系”进行了7天的分化，从而形成了神经突起。基于图像的分析显示，所有三个细胞系都形成了神经突起（图2B）。然后，研究者通过计算神经突起和固定尺寸的叠加框架测试线间的交叉点来估计每一行中平均神经突起长度，如前期研究所述，与测试线交叉的神经突起数量除以图像中存在的胞体总数，并用作测量神经突起的生长。通过ImageJ软件（fijiv.1.52p）的细胞计数器插件，从所有采集图像的子集中手动计算每个细胞的平均神经突数。研究者发现，与表达内源性NCDN的对照-Cas9系相比，两个NCDN缺陷系中的神经突起更短，数量更少。为了阐明改变的神经突起生长是否是NCDN缺乏的直接影响，研究者在KO#9克隆中表达WT-NCDN。用全长WT-NCDN构建物（pAcGFP1-N1-NCDN-WT）转染，然后进行分化，发现KO#9中的神经突的长度和数量都恢复了（图2C和2D）。接下来，研究者对受累个体的四种NCDN错义变体是否能够恢复NCDN缺失型的SH-SY5Y细胞的轴突长度和数量进行研究。为此，KO#9细胞转染含有四种NCDN变异的全长NCDN表达结构：c.Gc（p.GluGln）、c.1GA（p.ArgGlu）、c.Tc（p.TrpArg）或c.CT（p.ProLeu）。以WT-NCDN构建转染作为对照。转染后24小时，通过RA刺激细胞分化7天。基于图像的分析显示，与转染WT-NCDN的KO#9细胞相比，转染四种不同结构的KO#9细胞的神经突起长度和数量均持续减少（图2E和2F）。因此，这四种变体未能恢复与未转染的KO#9细胞相当的神经轴突表型。此外，转染pAcGFP1-N1空载体的KO#9细胞中的神经突起形成与未转染的KO#9细胞相似（图2E和2F）。这些数据表明，在NCDN缺失的SH-SY5Y细胞中受损的神经突起形成是通过WT-NCDN的表达而不是通过表达四种错义变体的NCDN结构来恢复的。

图2NCDN错义变异改变了SH-SY5Y细胞中神经突起的长度和数量

（A）免疫印迹分析WTSH-SY5Y（通道2）和两个独立的SH-SY5Y细胞克隆KO#2（通道3）和KO#9（通道4），CRISPR/Cas9诱导NCDN纯合缺失，证实NCDN蛋白缺失。使用抗Ncdn抗体（Sigma-Aldrich）和β-微管蛋白（Sigma-Aldrich）作为负荷对照。PageRuler加预染色蛋白梯段（lane1）作为分子量标记（Thermo）。

（B）对照组Cas9SH-SY5Y细胞（左）和两个独立的SH-SY5Y克隆KO#2和KO#9（中、右）的显微图像（细胞分化一周）。

（C）分化的SH-SY5Y系的轴突长度。克隆KO#2和KO#9与对照克隆（未转染gRNA的Cas9）相比，显示轴突长度减少。WT-NCDN表达后，KO#9神经突起长度完全恢复。数据标准化为平行分化的WT-SH-SY5Y细胞，并设为1.0。

（D）分化的SH-SY5Y系中的轴突数目。与转染Cas9的对照克隆相比，克隆KO#2和KO#9的细胞显示出减少的轴突数。在表达WT-NCDN后，KO#9细胞的突起数目完全恢复。数据标准化如（C）所示。

（E）在KO#9sh-SY5Y系中WT-NCDN和包含NCDN四个错义变异的过表达。WT-NCDN的表达恢复KO#9的轴突长度。相反，编码错义变异体p.GluGln、p.ArgGlu、p.TrpArg和p.ProLeu的NCDN的过度表达未能挽救KO#9中减少的轴突长度。转染对照组（GFP对照组）出现类似KO#9的突起生长。

（F）WT-NCDN的表达拯救了KO#9的神经突起数目。KO#9中四种NCDN变体的过度表达未能恢复减少的神经突数量。转染对照组（GFP对照组）的轴突数与KO#9相似。实验一式三份，数据以误差线表示的平均值±标准误差表示。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验对三个独立实验进行统计分析（?p0.01；?p0.）。

NCDN与由GRM1（MIM:）和GRM5（MIM:）编码的mGluR1和mGluR5相互作用，mGluR5的激活诱导细胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化，可作为mGluR活性的测量。因此，我们推断NCDN变体对mGluR1/5诱导的信号传导的影响可以通过ERK磷酸化的定量来评估。为此，GFP标记的WT-NCDN和四个突变构建体中的每一个与全长GRM5构建体共转染到KO#9细胞中。以转染KO#9细胞的GRM5构建体作为对照。24小时后荧光法检测转染效率，随后血清未加培养液24小时。通过二羟基苯甘氨酸（DHPG）诱导mGluRs活化，然后收获细胞。免疫印迹分析显示，与仅表达GRM5的细胞相比，表达WT-NCDN的细胞中ERK1/2磷酸化显著增加（图3A）。与WT-NCDN相比，当通过免疫印迹评估时，含有c.Tc或c.CT变异体的NCDN构建物的过度表达显示磷酸化ERK1/2水平显著降低。这一观察结果与编码mGluR5相互作用域的NCDN区域中两个错义变体的位置一致（图1D和3A）。14,28相反，NCDN变体c.Gc和c.1Ga的过表达取代了NCDN的mGluR5相互作用域之外的残基，对ERK1/2磷酸化无明显影响（图1A）。除了与mGluR5的相互作用外，NCDN还通过ERK和CaMKII的磷酸化来连接或介导一些对下游信号传导重要的蛋白质的激活。因此，研究者试图研究SH-SY5Y中NCDN的缺失对相互作用的mGluR1和mGluR5影响，以及对钙调素依赖激酶的影响。使用qPCR，我们在比较NCDN缺陷细胞和WTSH-SY5Y细胞时观察到三个NCDN相互作用伙伴的差异表达（图S4）。我们的研究结果表明，两个变体c.Tc和c.CT影响mGluR相互作用域中的残基，抑制mGluR1/5诱导的ERK磷酸化，并且SH-SY5Y细胞中的NCDN缺失导致属于mGluR途径的因子的表达改变。

图3NCDN变异干扰mGluR5信号并改变SH-SY5Y细胞的电生理特性

（A）与仅表达mGluR5的细胞相比，表达WT-NCDN或含有p.GluGln、p.ArgGlu、p.TrpArg和p.ProLeu变体的NCDN的转染KO#9细胞中ERK1/2磷酸化。DHPG诱导的细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化在血清饥饿转染的KO#9细胞中定量，这些细胞单独表达mGluR5受体，与WTNCDN共表达mGluR5受体，或与含有p.GluGln、p.ArgGlu、p.TrpArg和p.ProLeu的NCDN共表达。p.GluGln和p.ArgGlu使磷酸化恢复到正常水平，而位于mGluR5相互作用域的p.TrpArg和p.ProLeu则没有。免疫印迹法检测ERK1/2的磷酸化，其条带强度分别对应于磷酸化ERK1/2和总ERK1/2。磷酸化ERK1/2与总ERK1/2归一化。数据显示为平均值±误差线表示的平均值的标准误差。四个独立实验的统计分析采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验（?p0.05；?p0.01；?p0.；ns=不显著）。DHPG诱导ERK磷酸化的代表性免疫印迹（n=5，下图）。

（B）在保持电位为?70mV的分化SH-SY5Y细胞中，矩形电流注射和pA电流注射ms后诱发的流产动作电位（APs），表明NCDN缺失（KO#2[n=5]，KO#9[n=5]）和WT（n=15）SH-SY5Y细胞之间的衰变动力学不同。当注入电流为pa时，KO#2和KO#9（32.18±0.74ms）与WT-SH-SY5Y（33.35±0.64ms）细胞的平均上升时间相似。

（C和D）与WT-SH-SY5Y细胞相比，KO#2和KO#9sh-SY5Y细胞中90%AP衰变时间（C）和90%AP衰变幅度（D）显示AP衰变动力学发生显著变化。数据显示为平均值±误差线表示的平均值的标准误差。统计分析采用韦尔奇校正的非配对t检验（?p0.）。

（E）妊娠后6-37周胎儿大脑皮层中NCDN的细胞类型特异性表达。t-SNE图显示由NEUROD6表达定义的兴奋性神经细胞簇（左图）。该簇进一步分为表达NRP1的未成熟兴奋性神经元（iENs）和表达GRIN2B的成熟兴奋性神经元（mENs）。NCDN和GRM5主要在男性期表达。表达水平是按比例的，对数标准化数据来自seurat3。

（F）胎儿皮质兴奋性细胞群中5个基因的表达水平显示男性NCDN和GRM5表达丰富。RG，放射状胶质细胞；IN，中间神经元；iEN，未成熟兴奋性神经元；mEN，成熟兴奋性神经元。

参考文献：FatimaA,HoeberJ,SchusterJ,etal.Mono-allelicandbi-allelicvariantsinNCDNcauseneurodevelopmentaldelay,intellectualdisability,andepilepsy.AmericanJournalofHumanGenetics.Mar.DOI:10./j.ajhg..02..

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