对遗传性聋基因诊断的认识

耳聋发病率高，遗传因素是导致耳聋发生的最重要的病因。遗传性聋临床表型多样，包括综合征性聋和非综合征性聋。遗传性聋是经典的单基因遗传病，其遗传方式包括孟德尔遗传中的常染色体显性、隐性、性连锁传，也包括线粒体母系遗传和表观遗传。随着科学技术的发展，遗传性聋的基因研究取得很大进展，目前共发现个耳聋相关基因，为遗传性聋的基因诊断提供了可能。遗传性聋的基因诊断能够明确病因、预测迟发性聋、为患者及亲属提供遗传咨询、有效预防遗传性聋的发生，以及将遗传性聋分型和分类，指导临床耳聋管理、药物治疗或听觉干预。新一代测序技术与遗传性聋的基因研究结果结合，使临床广泛开展遗传性聋的基因诊断成为可能，但仍有许多问题待进一步解决。随着医疗大数据和云处理时代的到来，相信不久的将来，遗传性聋基因诊断一定会在临床广泛应用并成为疾病诊断的必备依据。

关键词

遗传性聋；基因诊断；基因型；表型

1遗传性聋概述

据年全国残疾人抽样调查数据，我国有听力障碍患者万人，占全国残疾人的33.5%，列各类残疾之首。在导致听力障碍的众多原因中，遗传因素是最重要的病因。据各国统计，每个新生儿中就有1例是听力障碍患儿，其中至少60%的新生儿听力障碍由遗传因素所致。另据流行病学研究显示，我国正常人群中至少5%-6%是耳聋相关基因携带者。因此，对于新生儿先天性永久性听力障碍，除非有明确的妊娠期病毒感染，所有听力损失患者都要考虑其遗传背景。即使是后天获得性听力损失，遗传因素也可能是重要的易感因素。遗传性聋是指由来自亲代的遗传物质即致聋基因或新发生的突变致聋基因传递给后代，所导致的耳部发育异常、代谢障碍、细胞结构或功能异常，以致出现听功能不良。遗传性聋中的70%是非综合征性聋（即不伴有任何非听觉内耳方面的症状和体征），30%是综合征性聋。遗传性聋中的绝大部分是感音神经性聋，极少部分是传导性聋、听神经病和中枢性聋。研究证实遗传性聋是经典的单基因遗传病，具有高度的遗传异质性，目前已经克隆的与遗传性聋相关的基因为个。随着科技的迅猛发展，将会有越来越多的耳聋相关基因被克隆和确定，这将为遗传性聋的临床基因诊断奠定基础。

2遗传性聋相关基因的研究现状

自年Leon等采用DNA微卫星标记基因连锁分析的方法定位了第一个常染色体显性遗传性非综合征性聋基因座（DFNA1）和年Prezant等第一次报道了线粒体12SrRNA位点A-G的突变是氨基糖甙类抗生素致聋的易感基因开始，人类进入了遗传性聋研究的新纪元。年Guilford等定位了第一个常染色体隐性遗传性非综合征性聋基因座（DFNB1），随后年Lynch等和Kelsell等相继克隆了第一个常显和常隐非综合征性聋基因，同期，综合征性聋的相关基因研究也取得进展。随着人类基因组计划的完成和基因定位克隆筛选技术以及测序技术的不断改进与完善，国际上遗传性聋致病基因的定位克隆及确定工作近年来取得了令人瞩目的进展。目前已有个非综合征性遗传性聋基因座被定位，包括64个常显基因座和个常隐基因座以及性连锁和其他相关基因座，至少个遗传性聋相关基因被克隆或确定。而遗传学家估计至少有-个基因与遗传性聋相关，仅从与人类共享99%同源基因的小鼠分析，在90个与内耳发育和功能相关的基因中，只发现28个基因与人类耳聋相关。因此，遗传性聋的基因克隆研究任重而道远。就目前的研究发现，遗传性聋几乎包含了所有的遗传方式，包括经典的孟德尔遗传即常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁显性遗传、X连锁隐性遗传以及Y连锁遗传，也包括线粒体母系遗传和表观遗传如DNA甲基化和rRNA基因沉默等，其中常染色体隐性约占80%，常染色体显性约占18%。此外也有新发突变致遗传性聋发生的报道。

遗传性聋的遗传异质性不仅表现在遗传方式和相关基因多样，还表现在基因突变类型的多样，如点突变、单个碱基或小片段的插入缺失突变以及大片段插入缺失突变和拷贝数异常等。且突变基因以及突变基因型热点不突出，在不同种族不同人群中存在差异。我国遗传性聋的流行病学研究发现，在已确定与非综合征性聋相关基因中，GJB2和SLC26A4基因的病理性突变导致遗传性聋的比例较大，所占比例分别约为21%和14.5%。其他耳聋相关突变基因和突变位点热点不突出，甚至有一些耳聋相关突变基因只在个别家系中得到验证。

遗传性聋的相关基因主要集中在缝隙连接蛋白家族（膜蛋白）、离子通道蛋白、非传统肌球蛋白家族（结构蛋白）、转录因子、细胞外基质蛋白以及参与细胞代谢的各种酶类等几类蛋白基因，也包含编码RNA的基因序列，表现出明显的遗传异质性。除此之外，遗传性聋还表现出表型多样，即综合征性聋或非综合征性聋，先天性或后天迟发进展性聋，轻中度至重度或极重度聋，低频、中频、高频或全频听力下降。从遗传性聋的基因型与表型关系研究中可发现，有的基因仅与综合征性聋有关，有的仅与非综合征性聋有关；有的仅与低频听力下降有关，有的与先天全频听力下降有关等；但也发现：同一基因不同突变表性差异可能很大，可引起综合征性聋，亦可引起非综合征性聋；既可导致显性遗传，也可导致隐性遗传。总之，遗传性聋基因型与表型同样复杂。尽管遗传性聋具有广泛的遗传异质性，但绝大多数非综合征性遗传性聋仅由单基因致病，这为遗传性聋临床基因诊断的开展提供了理论基础。

3遗传性聋基因诊断的意义

耳聋发病率高，在我国每年有3万左右聋儿出生，其中大部分为重度、极重度感音神经性聋。尽管自上个世纪90年代，世界发达国家和许多发展中国家均开展了新生儿听力筛查，为先天性耳聋患儿早期诊断与干预提供了保障，遗传性聋的分子生物学诊断（相关基因诊断）仍有不可替代的作用。首先，基因诊断可以明确近一半先天性耳聋的病因；其次，建立在新生儿耳聋基因筛查基础上的基因诊断可以尽早发现并诊断迟发性耳聋，为迟发性耳聋的早期干预创造条件；第三，耳聋患者的基因诊断可以为患者及亲属提供遗传咨询；第四，育龄夫妇的耳聋基因筛查和产前基因诊断可以有效预防遗传性聋的发生；最后，基因诊断可以将遗传性聋分型和分类，指导临床耳聋管理、药物治疗或听觉干预。同时，耳聋易感基因诊断可为通过预防致聋因素避免耳聋的发生提供依据。

尽管助听器和人工耳蜗等助听设备能够解决很多遗传性聋所致听力障碍问题，但昂贵的费用和少部分差强人意的康复效果，是许多患者及家庭难以接受。因此，对遗传性聋的有效预防是解决这一难题的有效途径之一。而遗传性聋有效预防的前提是耳聋基因诊断。新生儿听力筛查的普及为遗传性聋的相关基因筛查（基因诊断）提供了条件，二者的结合将是临床遗传性聋的早期规范化诊断的标准。通过建立高效的耳聋基因诊断技术平台和耳聋出生缺陷三级预防综合防控体系，采取有效的干预措施，减少耳聋出生缺陷，是我国人口战略的重大内容，意义深远。

4遗传性聋基因诊断的方法

尽管从20世纪90年代初起，国内外学者就开始研究耳聋的基因检测，但由于遗传性聋的相关基因目标未知，遗传学家只能通过微卫星连锁分析方法对单个遗传性聋家系进行相关基因的定位，并通过第一代测序技术（Sanger测序）进行基因突变的检测，或结合PCR－RFLP、PCR－SSCP、PCR－dHPLC等技术筛选相关基因的突变。少数通过基因功能克隆的方式确定耳聋相关基因检测到突变。进入21世纪，遗传学家通过共同祖先原理或SNP进行连锁分析，也取得了遗传性聋相关基因确定的一定突破。但是在很长一段时间里，由于DNA测序技术的局限性以及致聋基因突变的高度异质性，未知基因的遗传性聋的基因诊断临床应用有限。基于芯片技术和飞行时间质谱检测技术的热点突变快速筛查结合Sanger测序在国内很快被接受并应用于临床，具有简单、快速、方便、便宜等优点。目前已证实与遗传性聋相关的基因个，发现致病突变至少个，还有许多新突变被不断报道，因此，上述技术的缺陷是显而易见的。

近年来，分子生物学技术的大量创新性突破和国内外大量的耳聋基因基础研究，为开展耳聋临床基因诊断提供了良好的理论依据和技术支持，同时有越来越多的耳聋患者及家属要求了解自身耳聋病因。年Ng等利用大规模平行测序技术对一个体的全基因组外显子进行测序，开辟了人类基因诊断的全新时代。短短几年，遗传学家已利用第二代测序技术确定了十几个新的遗传性聋相关基因。如年报道了第一个使用大规模测序技术诊断非综合征性聋的病例。研究者对比了大规模测序技术和Sanger测序法的灵敏性与特异性，发现前者的灵敏性和特异性高达99.72%和99.00%，表明大规模测序技术可以为耳聋患者提供详尽的基因测定。年，Brownstein等用大规模测序技术测定了11例耳聋家系先证者中的个基因，结果发现11例耳聋家系先证者均没有GJB2基因的突变，但在6例家系先证者中发现了同一种突变基因，且为非综合征性聋基因；研究者随后为同种族的其他耳聋患者进行了基因测序，在20例耳聋家族得到了相同的基因诊断。这项研究显示了大规模测序技术在基因诊断中的潜力。最近有文献报道利用新一代测序技术发现一个由致病基因CACNAID所引起的新的综合征性聋，临床表现为耳聋与窦房结功能不良（sinoatrialnodedysfunctionanddeafness，SANDD）；研究者通过对比研究两个有血缘关系的基因型和表型相近的患病家系后发现，CACNAID编码L型电压门控通道的功能为控制内毛细胞带状突触谷氨酸盐的释放以及窦房结中钙离子的释放；体外试验亦证实了该基因的突变会影响钙离子通道。在没有基因诊断之前，SANDD患者多以非综合征性聋就诊，因为窦房结功能不全往往是在疾病后期患者发生晕厥后才被发现。

新一代测序技术不仅能够用于新致聋基因研究，且能更好的应用于已知耳聋相关基因突变诊断。年冯永等利用二代测序技术开发了针对个已知耳聋相关基因外显子测序的诊断方法，建立了IlluminaGoldengateK高通量耳聋基因筛查芯片工作平台。与此同时，深圳华大基因研究院采用安捷伦技术（Agilent的SureSelect液相靶向序列捕获系统）开发了针对51个耳聋基因外显子的高通量测序平台。年杨涛等应用已开发的针对79个耳聋相关基因外显子的新一代测序工作平台完成例耳聋的基因诊断。随着第二代高通量测序技术的发展与逐渐成熟，遗传性耳聋的临床基因诊断越来越准确、简单和快速。基于新一代测序技术基础上的耳聋相关基因外显子序列或全序列分析（目标基因的靶向序列分析）、全基因组外显子序列或全基因组序列分析已经变成现实。

5遗传性聋基因诊断存在的问题

在耳聋的基因诊断中，临床表型可以提供重要信息。如临床证实前庭导水管扩大的患者至少95%的致病基因是SLC26A4基因，听神经病谱系障碍的患者至少可以先在OTOF、DIAPH3、PJVK、WFS1、SLC17A8、TMEMA等基因范围内检测突变，许多综合征性聋的基因诊断也可以在有限的基因范围内进行。然而更多的耳聋患者基因诊断没有明确的范围，对于无遗传背景和相关遗传信息以及特质表型信息的耳聋患者，进行耳聋基因诊断是很困难的。即使是在一定范围内进行相关基因的筛查，由于相关基因的数十个外显子如SLC26A4基因，其诊断仍费时耗力，工作量大，并存在漏诊内含子内突变致病的风险，临床难以推广。尽管应用新一代测序技术进行全基因组外显子或全基因组测序，从理论上解决了遗传性聋遗传异质性覆盖问题，应用目标基因靶向捕获和新一代高通量测序技术与包含目前已知的遗传性聋相关基因的生物信息学以及信息工程相结合进行遗传性聋基因诊断降低了成本，但由于捕获测序对样本需求量大，所得信息量相当大，且费用较高，不利于遗传性耳聋基因筛查与诊断的临床普遍推广。

目前国内外采用耳聋基因筛查策略对耳聋患者进行基因诊断，有助于耳聋基因诊断的实践和推广，在一定程度上为耳聋患者提供了有价值的信息。但是，无论是4个基因9个位点还是4个基因16个位点的耳聋基因筛查试剂盒，都存在提供信息不全面的缺陷。对于显性遗传方式或母系遗传方式的患者，明确的致病基因突变位点检出可以做出比较明确的基因诊断；对于占遗传性聋大多数的隐性遗传方式患者，筛查出单杂合致病基因突变位点并不能得出明确结论，须进一步进行该基因的全序列分析；对于没有筛出致病基因突变位点的患者，不能排除遗传性聋的可能。

无论采用何种方法进行的遗传性聋的基因诊断，其结果基本分以下几种情况：①检测出已知致聋基因的已知明确的致病突变，且符合遗传特性，临床可以明确基因诊断。如GJB2c.delC纯合突变，SLC26A4c.AG/IVS7-2AG等。②检测出已知致聋基因的已知明确的非致病碱基改变，临床报告SNP。如99.99%的同义突变等。③检测出已知致聋基因的已知罕见的碱基改变，未有致病报道，各种SNP数据库暂列为SNP。这种情况有两种可能，一是确为SNP；另一是隐性致病突变的杂合状态。随着越来越多耳聋患者基因筛查诊断和大数据的建立，诊断结果将会逐渐明确。④检测出已知致聋基因的新的碱基改变，同义突变一般认为是SNP，但不排除极罕见的致病性；错义突变难以明确致病性；无义突变和移码突变一般认为是致病突变；大多数片段插入与缺失是致病改变，少数除外。拼接位点的碱基改变致病性可能性大，内含子内的碱基改变更可能是SNP，但也有极个别产生新的拼接位点而致病的报道。⑤已知致聋基因未检出致病突变和新的碱基改变，但检测出新的基因突变。⑥检测出基因重排，包含已知致聋基因的，其致病性明确；未包含已知致聋基因的，需要进一步明确。

第4、5两种情况的碱基改变最需要结合患者的临床信息并在耳聋患者和正常人群中进行验证，有一些碱基改变还需要功能验证。从以上结果不难看出，尽管检测技术能够检出所有突变，通过建立生物信息数据分析软件包能够高效分析庞大数据信息，仍有部分检测出的基因碱基改变需要通过进一步的分析与功能验证才能明确致病性，部分遗传性聋需要进一步进行相关基因的研究。因此利用新一代测序技术进行遗传性聋的基因诊断虽然临床应用前景广泛，但就目前而言仍有一定的局限性。

作为经典的单基因遗传病，遗传性聋的基因诊断具有其简单性；但遗传性聋高度的遗传异质性（即涉及的基因达个之多且涵盖所有的遗传方式等）使遗传性聋的临床基因诊断复杂化。值得







































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